靶向BTK药物研究中相关药效学生物标志物研究策略

第一代和第二代BTK抑制剂都是共价抑制剂。 通过与BTK的ATP结合袋内的特定Cys-481共价结合发挥药物的抑制作用。但是癌症的治疗过程中，会导致BTK的481位发生突变，比如C481S（即半胱氨酸突变为丝氨酸），丝氨酸没有一个强的亲电子的硫醇，只有一个羟基，它的反应性比硫醇小得多。所以小分子共价BTK抑制剂不再能很好地发挥作用，这时就产生了耐药性。因此，第三代BTK抑制剂，即不需要和BTK蛋白上的C481形成共价键的药物，将能够克服耐药性。除了礼来公司的非共价BTK抑制剂吡托布鲁替尼（Jaypirca）批准之外，非共价、可逆的BTK抑制剂，还包括基因泰克公司的非尼替尼（GDC-0853）、Sunesis公司的维卡替尼（SNS-062）、ArQule公司的ARQ-531（MK-1026）等等也都在临床研究阶段，预计近年也会陆续上市。

 图2. BTK PROTAC作为一项较新的抗癌策略。PROTAC是双功能分子，由通过短接头连接到E3连接酶招募部分的靶向配体组成（Cell Research (2016) 26:484-498）

目前检测BTK占据的方法原理是通过同时检测Total BTK（总的BTK）和Free BTK（游离BTK，是未结合BTK的抑制剂），一般采用一对BTK抗体使用双抗夹心法检测总的BTK；对于游离BTK方法，一般是将BTK抑制剂标记上生物素（Biotin），包被在亲和素覆盖的板子底部，然后去竞争性的结合样本中游离的BTK，从而检测出Free BTK含量。然后采用下图的公式计算出占据率。

Post BTK_Free指的是给药后样本中检测到的游离BTK含量，Post BTK _Total 指的是给药后样本中的总的BTK含量，Pre BTK_Free和Pre BTK_Total指的是给药前样本中的游离BTK含量和总的BTK含量。

图3. 基于免疫分析平台的BTK占据检测（Free BTK和Total BTK）方法的Format

图4. TR-FRET技术检测Free BTK和Total BTK（注：图片来自SLAS Discov. 2018 Oct;23(9):919-929）

BTK PROTAC药物会降解掉细胞中的BTK蛋白，因此评估BTK PROTAC的药效学方法就是检测BTK蛋白的含量是否降低 ，可以通过免疫组化IHC的方法检测肿瘤组织切片中的BTK蛋白变化，在临床实际操作中，往往也是通过检测PBMC样本中的BTK蛋白含量的变化相对更容易操作一些。检测BTK蛋白的技术目前也主要是通过Western Blot、ELISA等方法进行检测，操作简易，数据可靠。

BTK的突变检测 ，主要还是检测BTK的耐药突变， 比如C481S（即半胱氨酸突变为丝氨酸），该检测往往用于一些临床试验的入组筛选或疗效预测。目前根据检测的目的和要达到的检测程度，采用的检测技术包括qPCR、NGS等进行。