杰论系列 | AAV载体基因治疗药物的免疫原性研究

近年来腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体逐渐发展为基因治疗领域的热门递送平台，野生型 AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组，需要依赖腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。临床应用中使用不需要辅助病毒的重组 AAV 病毒（rAAV）将目的基因的 CDS 区序列插入 rAAV 表达质粒中，包装病毒，然后直接使用 rAAV 感染细胞就能完成目的基因操作。  作为一种基因导入系统，AAV病毒载体具有安全性好、免疫原性低、能感染分裂细胞和非分裂细胞、能介导基因的长期稳定表达等优点，因此在神经系统、眼科和代谢类疾病的研究中，受到越来越多的关注和重视。

腺相关病毒(AAV)最早于1965年首次在实验室的腺病毒制剂中被发现。在后续的十多年里，科学家们主要将研究方向集中在AAV的基因结构与组成、DNA的复制与转录、感染的潜伏性以及病毒粒子的组装等方面，并于1982年成功完成了AAV2基因组的克隆以及测序工作，AAV的神秘面纱逐渐被揭开。这些早期研究为AAV作为基因递送载体而被广泛使用提供了坚实的理论基础。

AAV载体于1995年首次用于治疗人类的囊性纤维化病，步入21世纪后越来越多的AAV血清型家族被发现，这极大的丰富了体内基因递送的AAV载体工具箱。2008年基于AAV载体的基因疗法在治疗莱伯氏先天性黑蒙症的疗效方面取得了令人信服的证据。2012年首个基于AAV的基因治疗药物Glybera获得了欧洲药品管理局EMA的批准，5年后Luxturna成为首个获得美国食品药品管理局FDA批准的用于治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病的AAV基因治疗产品。

图2. AAV发展史（注：图源网络）

截止到目前，全球范围内已上市的AAV基因治疗产品共有5款（表1），极大地推进了该领域的发展。

表1. 目前获批的AAV基因治疗产品

以AAV检索http://Clinicaltrials.gov数据库，全球共有200多项AAV递送蛋白质基因相关的研究项目，适应症多为血液疾病、眼部疾病和神经系统疾病。

国内该领域大部分产品处于临床前阶段及早期临床阶段。  国内眼科基因治疗头部企业纽福斯的NR082眼用注射液在中国已经完成一期、二期临床试验，正在开展三期临床；信念医药BBM-H901、天泽云泰VGB-R04等产品均已进入临床试验阶段，康弘药业、北海康成等众多企业也分别布局了AAV基因疗法，  整体而言已经呈现“百家争鸣”的大趋势  。

AAV相对于其它病毒载体有较好的安全性，但非预期的免疫反应依然是AAV药物开发需要关注的重点。针对AAV的免疫反应既可能是体内预先存在的中和抗体，又可能是AAV激活固有免疫产生急性毒性，又或者是产生针对AAV或其蛋白产物的适应性细胞免疫或体液免疫。

AAV载体的基因治疗药物的免疫原性主要考虑3个方面：载体的免疫原性评估，核酸的免疫原性评估及蛋白表达产物的免疫原性评估。

以载体的免疫原性评估为例，抗载体衣壳蛋白的ADA，可采用常规基于ELISA或MSD平台的间接法或桥连法进行评估（如图4），在此不再赘述。

图4. AAV载体的免疫原性评估（注：  图源网络）

针对与wtAAV的衣壳相同或相似的rAAV衣壳。由于天然wtAAV感染，在大部分人群血液循环中有预存的NAb，并且它会有效地阻断rAAV基因转导，导致药物无法发挥药理学活性。因此，存在抗AAV中和抗体阳性的患者无法接受相应治疗，NAb筛查和排除血清反应阳性受试者是相应临床研究中的必要步骤。

表2. 人体中常见不同血清型AAV的预存抗体比例（注：图源网络）

首先构建一个和基因药物有相同衣壳蛋白的腺相关病毒，AAV-GFP，该病毒能自主表达绿色荧光蛋白。使用AAV-GFP感染细胞，通过检测荧光信号来评判感染的效果。在AAV-GFP感染细胞之前，将其与血清样本进行预先孵育，血清样本中的抗AAV中和抗体能够阻断AAV-GFP感染细胞，导致荧光信号的衰减，从而评价血清中抗AAV中和抗体的效果。该方法可用于中和抗体的预筛及给药后的中和抗体的检测。

图5. 抗AAV中和抗体检测原理（注：图源相关公司公众号）

AAV载体基因疗法中，NAb的存在与较差的治疗疗效相关，因此检测中的阳性有时被用作临床试验的排除标准，同时，由AAV诱导的Nab又限制了相同血清型衣壳的再给药。因此，准确检测可能抑制病毒衣壳转染靶细胞能力的抗体（也称为NAb或转导抑制试验），显得尤为重要。

一般LBA方法用于检测抗AAV总抗体，细胞法用于检测抗AAV中和抗体。

常规的桥接法检测ADA/NAb，比基于细胞的方法拥有更好的灵敏度和特异性，但是由于转导抑制过程的复杂性，此方法的科学性需要进行论证。

对于商业化产品，ADA/NAb检测可被认为是CDx，并应在美国CLIA认证的实验室进行。在中国，通常需要ISO 13485和GMP认证。

当考虑使用抗衣壳抗体检测(ADA和NAb)时，需要评估的几点原则：

尽管基于AAV载体的基因治疗产品在临床上取得了令人鼓舞的结果，但这种新型的体内基因递送平台还存在很大的局限性与挑战性，较小的基因组和中和抗体限制了其在许多疾病中的应用。

在全球利好和资本青睐的趋势下，基因疗法将有更深远的发展。作为基因疗法中广泛使用的AAV载体，其工程化以及搭载双抗在眼科、CAR-T疗法的替代等领域，都具有极富潜力的应用前景。本司拥有AAV载体基因治疗药物免疫原性研究相关的检测平台和丰富经验，期待更多的技术交流和合作。

参考资料：