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【杰论系列】胰腺癌CAR-T安全疗法的新靶点——CEACAM7

返回列表 来源: 发布日期: 2022.03.30


胰腺癌简介及CAR-T细胞疗法胰腺导管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC)是第四大常见致死率高的的实体瘤,其5年存活率不足5%,因早期缺乏明确的症状,多数患者诊断时即为晚期,表现为广泛转移。传统疗法很难治愈PDAC,最多能延长几个月的寿命, 并且PDAC存在显著的遗传异质性和肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC),这些都极大地促进了疾病的发展和对化疗的耐药性,因此亟需找到新的、更有效的靶向治疗方法。
CAR-T细胞疗法在表达CD19的B细胞恶性肿瘤和血液瘤中显示出显著的疗效,但在实体瘤中疗效有限,主要原因是相比癌症组织,CAR-T疗法会给机体其他组织产生一定的毒性影响,因为目前CAR-T细胞定向到胰腺癌细胞和其它实体瘤的大部分蛋白质也在其它正常组织中以低水平存在,从而就会诱发毒副作用的发生。因此缺乏在恶性细胞上高表达且在正常组织中不表达的CAR-T靶抗原来阻止靶向非肿瘤毒性。CEACAM7 (CGM2)是一个目前研究比较少的CEA家族蛋白成员,CEA家族蛋白具有多种功能,在恶性肿瘤中常见失调。研究发现CEACAM7其表达局限于结肠和胰腺,但该蛋白却在一些正常组织中并不表达,本文推测CEACAM7或许能作为一种安全疗法靶点帮助开发治疗胰腺癌的新型策略,并对此进行了研究,同时制备了CEACAM7靶向CAR-T细胞以验证这一假说。 CEACAM7在PDAC肿瘤组织
和正常组织中的表达为了评估CEACAM7蛋白在PDAC样本中的表达情况,对一组人类PDAC肿瘤切片进行了免疫染色,结果显示在30个肿瘤切片中有19个肿瘤切片呈CEACAM7中或高表达,11个肿瘤切片CEACAM7表达很低或检测不到。为了进一步评估CEACAM7在正常组织中的表达,对与PDAC肿瘤切片相同的组织芯片上的正常组织切片进行免疫染色,结果显示在正常胰腺或结肠组织中均未检测到CEACAM7表达。研究发现CEACAM7其表达局限于结肠和胰腺,该蛋白在扁桃体、肺部组织、肝脏和前列腺正常组织中均未检测到表达。这就表明,CEACAM7或许能作为一种理想的靶点帮助开发治疗胰腺癌的CAR-T细胞疗法。
之前的研究报道CEACAM7可在胰腺和结肠中转录表达,本文从正常捐赠者的组织中分离RNA进行RT-PCR,结果发现这些组织中可检测到CEACAM7的转录表达,与在细胞系和患者的原代细胞培养中的表达水平具有可比性。与PDAC原代细胞系相比,CEACAM7的抗原表达显著降低,提示PDAC中CEACAM7蛋白的上调可能发生在转录后水平。进一步采用qRT-PCR来评估I-II期PDAC患者原代培养物中CEACAM7 mRNA转录本的表达。结果发现7个PDAC原代培养物中有3个细胞检测到CEACAM7转录本表达上调,且在人类胰腺中低表达,在血细胞和非PDAC细胞类型中均未检测到表达(图1C)。同时发现CEACAM7在肿瘤干细胞富集的亚群中高表达,这表明CEACAM7有可能靶向肿瘤干细胞的关键区域(图1C)。
为了进一步研究CEACAM7在正常组织中的表达水平,通过qRT-PCR分析了3个人类正常组织中CEACAM7的转录表达,组织包括肾脏、肺、骨骼和心肌、内脏和皮下脂肪、肝脏、大脑、卵巢和乳房,结果发现与原代培养的PDAC细胞系相比,在这些组织中均未检测到CEACAM7表达(图1D)。为研究CEACAM7转录本是否与PDAC中细胞表面CEACAM7表达相关,使用I-II期局部疾病患者的原代培养或晚期转移性疾病患者的血源性CTCs,对2869杂交瘤细胞上清液进行流式细胞术检测显示3个转移性PDAC培养物中有1个培养物CEACAM7高表达,5个I-II期PDAC培养物中有2个培养物CEACAM7高表达,同时发现大多数PDAC肿瘤的CEACAM7表达局限于上皮细胞的顶端表面。


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图1 CEACAM7在PDAC肿瘤组织和正常组织中的表达开发靶向CEACAM7的
新型2869 CAR-T细胞本文进一步研究2869杂交瘤细胞对CEACAM7的特异性。354和c102 PDAC培养物在贴壁培养时未检出CEACAM7表达(图1E),对354和c102 PDAC培养物进行修饰来表达GFP和荧光素酶(354GL和c102GL),以便在体内和体外进行跟踪。为了评估2869抗体对CEACAM7蛋白的特异性,本文进一步修饰354GL和c102GL细胞来稳定表达CEACAM7。2869杂交瘤细胞上清的Western blotting结果显示CEACAM7成功异位表达,且CEACAM7在c102GL中的表达高于354GL(图2A)。本文基于2869 抗体的重链和轻链的可变区生成了一个 scFv,将2869 scFv-Fc融合体转染到293T细胞中,用含有分泌蛋白的上清液在修饰和未修饰的354GL上进行流式细胞术检测,结果显示2869 scFv - fc显示了与2869杂交瘤上清相似的结合模式,2869 scFv-fc与异位表达CEACAM7的细胞特异性结合,证明了2869 scFv可用于开发靶向CEACAM7的CAR-T细胞(图2D)。通过将2869单链抗体与铰链结构域和CD8a跨膜结构域融合,在CD137(4-1BB)共刺激结构域和CD3z激活结构域的框架内构建第二代嵌合抗原受体,一些研究表明表位结合域与T细胞表面的距离可以显著影响CAR-T细胞的功能,因此,本文针对CEACAM7蛋白的抗体的一部分结构制造出了两种新型CAR,一个有45个氨基酸CD8α衍生铰链,一个有12个氨基酸IgG4衍生铰链 (图2E),两种CAR都可以有效地转导到人类T细胞中,表达量在40%到90%之间。

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图2 开发新型的2869 CAR-T细胞2869 CAR-T细胞靶向CEACAM7的特异性制造出了新型的CAR细胞,随后修饰杀伤性T细胞使其能够在表面上展现新型的CAR蛋白来识别并结合CEACAM7,并能够指挥杀伤性T细胞杀灭仅携带CEACAM7的细胞。为了研究2869 CAR对CEACAM7靶点的特异性和疗效,将CEACAM7异位表达的354GL细胞和c102GL细胞作为CAR-T细胞的靶点,未修饰的细胞作为阴性对照。未修饰的T细胞或修饰后表达2869 CARs的T细胞,以5:1的E:T比例覆盖在PDAC靶细胞的单层上。通过GFP表达来评估靶细胞的活力。与2869 CAR-T 细胞类型中的任一种共培养后,观察到 CEACAM7 表达的靶PDAC细胞裂解,但未修饰的细胞未观察到裂解(图3A和B)。WST-1对靶细胞定量结果显示2869 CAR-T细胞对未修饰的PDAC细胞没有任何影响,当E:T比例为5:1和1:1时,CEACAM7表达的靶细胞活力降低。而细胞毒性杀伤似乎与抗原密度相关,c102GL的细胞毒性高于354GL细胞,这与c102GL细胞中CEACAM7表达较高一致。当CAR - T细胞以E:T为5:1比例应用于任一靶细胞类型时,较小的2869 CAR细胞 (IgG4铰链)具有轻微但显著较高的细胞毒性功效(图3C和D)。说明2869 CAR-T细胞有效靶向表达CEACAM7的贴壁生长的PDAC细胞——354GL细胞和c102GL细胞,而对不表达目标抗原的细胞没有影响。
为检验T细胞穿透肿瘤微环境屏障的能力,将表达CEACAM7或不表达CEACAM7的354GL和c102GL细胞进行球体培养7天,然后以E:T为5:1添加效应T细胞,结果发现添加2869 CAR-T细胞后,表达CEACAM7的球形培养物完全溶解,而未修饰的不受影响。因此,研究表明2869 CAR-T细胞可以靶向表达CEACAM7的PDAC球体培养物,在体外条件下富集CSC并再现基质屏障。同时发现2869 CAR-T细胞在贴壁或球形培养下被目标抗原特异和有效地激活。

图3 2869 CAR-T细胞的体外疗效图片


为了评估CAR-T细胞活性是否在体内持续存在,本研究原位植入354GL细胞,构建了I/II期PDAC异种移植模型,此模型肿瘤移植并迅速扩张,并在肿瘤植入后第6天和第13天给予两剂2869 CAR-T细胞治疗(图4A),在354GL队列中,肿瘤持续快速发展,所有小鼠在第23天肿瘤负荷明显。在354GL±CEACAM7队列中,肿瘤显著消退,5只小鼠中有4只小鼠的肿瘤被完全清除(图4B和C),然而该队列中的所有动物都死于移植物抗宿主病(GvHD),并在第38天实施安乐死(图4D)。为了研究2869 CAR-T细胞对更大、更成熟肿瘤的疗效,本文采用354GL±CEACAM7细胞建立了第二种异种移植模型,并监测了肿瘤在体内生长的情况,当肿瘤达到一定大小时,在第13天和第20天注射了两剂2869 CAR-T细胞(图4E),354GL组的所有动物迅速死亡,而354GL±CEACAM7组的5只动物中有4只动物观察到肿瘤稳定且生存时间被延长(图4F和G),说明了2869 CAR-T细胞对来自患者原发性PDAC培养的异种移植模型具有体内抗原特异性。

图4 2869 CAR-T细胞的体内疗效2869CAR-T细胞靶向CEACAM7图片


表达的肿瘤细胞患者来源的PDAC细胞系c76和253细胞在贴壁培养时CEACAM7的表达水平低于球体培养细胞(图1E),因此贴壁培养的c76和253细胞用来评估2869 CAR对内源性CEACAM7表达的活性。研究发现2869 CAR-T细胞使c76和253细胞单层裂解,而未修饰的T细胞则没有影响(图5A)。WST-1靶细胞定量结果显示2869 CAR-T细胞以效应细胞剂量依赖的方式裂解两种靶细胞,观察到E:T比例为 5:1比E:T比例为 1:1有更高的细胞毒性(图5B)。同时2869 CAR-T细胞与靶细胞PDAC共培养时,观察到IFNg分泌增加(图5C)。因此本文构建了一个具有类似细胞内共刺激和激活域的突变型CAR,但缺乏scFv表位结合域(图5D)。与突变的CAR-T细胞相比,使用PDAC 253靶标的细胞毒性显示2869 CAR-T细胞具有显著的靶向裂解作用,表明2869 CAR-T细胞对CEACAM7具有特异性靶向作用(图5F)。

图5 2869 CAR - T细胞靶向原代PDAC细胞系中内源表达的CEACAM7图片



为了研究CEACAM7在更多细胞系中的表达,研究者构建了6个PDAC细胞系,显示2869CAR-T细胞与所有细胞类型结合,与PDAC c76培养物的表达水平相似,低于修饰后的354GL细胞中CEACAM7的异位表达水平 (图6A和B)。同时发现CEACAM7在PDAC细胞系和原代培养细胞中均表达,在细胞表面表达水平相似。为了进一步验证2869 CAR的特异性,将354GL±CEACAM7与突变的CAR - T细胞或2869 CAR - T细胞共培养,E:T比例为3:1。显微镜和WST-1靶细胞定量结果证实2869 CAR - T细胞能够特异性靶向CEACAM7表达的肿瘤细胞,而突变的CAR-T细胞对抗原表达或不表达的细胞系没有影响(图6C)。进一步使用2869 CAR-T和突变的CAR-T细胞作为对照,对所有6个PDAC细胞系进行了细胞毒性试验。在E:T比为3:1和1:1时,所有PDAC细胞系与2869 CAR-T细胞共培养时均观察到显著的细胞毒性。细胞毒性与PDAC原代培养物的细胞毒性相当,但比异位表达354GL±CEACAM7的细胞低(图6D和E)。这些数据进一步证明了2869 CAR-T细胞对CEACAM7表达的PDCA培养细胞的特异性。

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图6 2869 CAR - T细胞靶向CEACAM7表达的PDCA细胞系2869CAR-T细胞可延缓PDCA患者来源的异种移植瘤的生长将贴壁培养的PDAC c76GL细胞原位植入NSG小鼠。细胞取自于患有转移性晚期PDAC患者的血液,具有侵袭性强、生长快速且广泛转移特点。监测肿瘤大小达到>0.5 cm3,并且出现可检测的转移,来准确模拟人类患者晚期疾病表现。在这个阶段,给动物注射5*106突变的CAR-T细胞或2869 CAR-T细胞(图7A)。使用突变的CAR-T细胞治疗的5只动物全部观察到肿瘤持续发展,2869 CAR-T细胞治疗的5只动物中只有2只观察到肿瘤的持续发展。在2869 CAR-T细胞队列的应答动物中观察到原发肿瘤和肝转移完全消退(图7B和C)。同时发现2869 CAR-T治疗组的总生存期明显优于突变的CAR-T治疗组。因此,这些结果表明2869 CAR-T细胞可延缓患者来源的异种移植瘤的生长,在侵袭性和转移性的异种移植模型中引起大肿瘤和转移的完全消退。

                                                                                                      图7

图7 2869 CAR - T细胞在体内靶向弥散性异种移植肿瘤结论本研究表明CEACAM7确定为PDAC的潜在安全治疗靶点,而且构建了靶向CEACAM7的CAR-T细胞,并通过体外和体内模型评估CEACAM7 CAR-T细胞的抗肿瘤疗效。靶向CEACAM7的CAR-T细胞能够靶向抗原表达的胰腺癌细胞,而对非肿瘤组织没有明显的毒性,并可延缓患者来源的异种移植瘤的生长。


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图8 MEDx CAR-T临床检测推荐列表图片


参考文献:
Raj D, Nikolaidi M, Garces I, et al. CEACAM7 Is an Effective Target for CAR T-cell Therapy of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Cancer Research. 2021.
内容:市场部 许晓雪编辑:Sally校正:Chao.Z/Grace/Sally

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本文标签: 实体肿瘤试剂 检测试剂盒 血液肿瘤试剂 传染病医疗检测试剂

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