肿 瘤微 环 境（ T um o r M ic r oe n vi r on m en t ，T ME）是一个 复杂 的综合系统， 主要由肿瘤细 胞、周围的免 疫和炎症细 胞 、肿瘤相关 的 成纤维细 胞 、附近 的 间质组 织 、微血 管 、各种 细 胞因子 和 趋化因 子 构成。肿 瘤细胞 与其 所处的 微环境 作为 一个功能 整体 ，两者相互 影 响、共同进化 ， 所 以肿 瘤的 发生 与发 展不 仅与 肿瘤 细胞 本身 相关 ，同样与 TME密 切相 关 ^{[ 1]} 。 在过去 的十年 中， TM E已 经成 为癌 症治 疗最 重要 的研 究对 象之 一 ^{[ 2]} 。

随 着精准 医疗 的 发展 ， 在各 类 癌症 的 免疫 治 疗应 用 中， 对 临床 评估T ME的 需求也越来 越 强烈^[3-5] ，而当 下免 疫肿瘤学 研究 多集中在 特定免疫 细 胞亚群 在其空 间 环境中 的 作用。 对 TME 更 深层次 信 息的需 求推 动了 新技术 的 发展，如 多 路成像^[6] 、 质谱流式细 胞术 ^{[ 7]} 及 单细 胞 R NA 测序 ^{[ 8]} 。 虽然 质谱 流 式 细 胞术 和 单 细胞 测 序 是研 究 TM E 的有 效 方法 ， 但 无 法 很 好 地 解 释肿 瘤 细 胞与 周 围 各要 素之 间 的 空间 联系 。

利 用免疫 学和 细 胞化 学 原理 ， 多重 免 疫组 化 （M u lt ipl eI mmuno hi toche m itry , mIHC ） 技术通过在 同 一张切片 上 同时或 先 后采用 不 同颜色 的 荧光色 素 或酶促 产 物，来 原 位示踪组 织或细 胞内 不同的 抗原 大分子 物质。 mI HC采用 呈现 不同颜色的 荧 光色素配伍， 分 别 标 记 不 同 的 抗 体 ， 再 通 过 各 自 与 同 一 切 片 上 的 相 应抗 原 特异性 结 合而加 以区别 显示。

与 大规模 细胞 检 测和 单 细胞 转 录分 析 相比 ， mI H C技 术不仅 可以使 FFPE样 本在更 好的分辨率 下 显示肿瘤细 胞 与TME的 关 系，而且其 技 术原理相 对 成熟且 操 作便捷 ， 在TM E 研究中 具 有独到 的 优势^[10] 。

mIHC 检 测肿瘤 微环境 相关信息，为免疫 治疗提供更全面评 估

在 肿瘤 精 准治 疗 时代 ， 现有 的 生物 标 志物 识 别模 式 （ 即 根据 特定基 因的突 变检测结果 预 测药效 ） 并不适用于所 有 受到免疫治 疗 的患者 ^{[11 ]} 。 肿 瘤的异质 性 决定了 其肿瘤 微 环境的 复 杂性， 而肿 瘤中 免疫细 胞 的活化/ 抑制状 态、免 疫 细胞密度 、 肿瘤细胞 之间的 空间 位置甚至肿 瘤内 微血 管的 生成 等都 将对 免疫 治疗 的应 答评 估产 生重 要影 响。 多 种途径 共同 决 定了肿 瘤和 免 疫细 胞之 间的 相互 作用 ，将 这种 相互 作用 精炼 到一 个单 一的 生物 标 志 物 提 升 了 靶 向 药 物 或 免 疫 药 物 的 有 效 率 ， 但 是 从 某 种 程 度 上 讲 也 是 一 种 过 分 简 化 ^{[ 1 1 ]} 。

Taube等人通过mIHC对非小细胞肺癌石蜡包埋组织切片进行处理。结果发现肿瘤细胞与CD68+巨噬细胞均表达PD-L1，罕见的CD8+T细胞部分表达PD-1，同时环境中存在FoxP3+调节性t细胞（图1） ^{[ 11 ]} 。研究人员认为，未来的生物标志物策略无疑将包括对肿瘤先天和适应性免疫反应以及肿瘤本身内在特征的更全面的评估。肿瘤微环境在某些肿瘤类型中被认为与预后独立相关，未来基于TNM分期系统的肿瘤分期标准可能会将免疫相关指标综合考虑在内 ^{[ 11 ]} 。

图1.非小细胞肺癌mIHC（福尔马林固定，石蜡包埋切片，橙色肿瘤细胞，紫色CD68+巨噬细胞，绿色PD-L1，黄色CD8+t细胞，青色PD-1，红色FoxP3+调节性t细胞，蓝色DAPI ）

mIHC/IF 联 合多种 生物标 志物预测免疫治疗 效果或更具准 确性

一 项20 19 年 7月 发 表在 《 JA M AO n co l 》囊 括了1 0余种 不同实体肿 瘤 类型的81 3 5名患者的 研 究显示，m I HC/IF 和 多种生物 标 志物联 用 策略， 或 比仅P D -L1 IHC 、 肿瘤突 变 负荷（T MB） 或基 因表达 谱（ GEP ）的免 疫治疗 疗效预测 性能 更佳^[9] 。

研 究共分 析了 8 13 5 名患 者 代表 、 10 余 种不 同 实体 肿瘤类 型的肿 瘤标本。在 此 研究中，T M B、PD- L 1IHC 、 GEP的预 测 性能相似 ， 而mI H C/I F 和多种 生 物标志 物 联用策 略 或比单 一 PD-L 1IH C 、TMB 或 GEP的 性能 更强^[9] 。

不 可否认 的是 ， mI H C/ I F对 免 疫治 疗 应答 的 预测 效果还 需进一 步研究来证 实 ，但不失为 一 种具有潜力 的 免疫治疗预 测 方法。

迈杰转化医学mIHC整体解决方案

迈 杰转化 医学 研 究（ 苏 州） 有 限公 司 已经 建 立并 完 善了 多色免 疫组织 化学染色的 技 术平台和多 个 检测pan e l的方法学 验 证，能够对 组 织切片中 多 达6个 免 疫荧光 标 记物进 行 成像和 分 析（图 2 ，6个 免 疫荧光标 记物+ 1个 核染色 ）， 可以对 实体肿 瘤微环 境中的细 胞表 型和活性进 行精 准定 量评 估， 同时 提供 了组 织背 景和 细胞 间相 互作 用的 空间 信息，具 有 卓越 的技 术 方 法优 势 。

图2.乳腺癌组织7色mIHC染色（红色CD20 ；黄色CD8 ；绿色CD4 ；洋红色：PD-L1 ；青色：细胞角蛋白 ；橙色FoxP3 ；蓝色：细胞核 ）

迈 杰转 化 医学 m IH C 工作 流 程包 含 三个 主 要环 节 ：荧 光标记 -多光 谱成像-组 织 图像分析。 通过活 性荧光团共价 标记表位，多 光谱成像则 消 除了荧光 团 的串扰 和组织 自 发荧光 的 干扰， 允 许对组 织 样本中 的 每个荧 光信 号进 行精确 检 测。组织 图 像分析确定 了每个细 胞和每 个亚细 胞间室的 荧光 强度 值并 形 成 可视 化图 像。 部分 已验 证组 合见 迈杰 转化 医学 mIHC 成 像示 例图 （ 图 3） 。

图3a. 扁 桃体 组 织的 P D- L 1 &C D 4& C D8 mI H C染 色（迈 杰荧光 合成图像， 红色PD-L1 ，黄色CD4 ，绿色CD8 ，蓝色DAPI ） ; 图 3b. 扁桃 体组 织的VI M&Gr z B&C D4& C D8 mI HC 染色（ 迈 杰荧光合 成图像 ， 橙色VIM ， 红色GrzB ， 黄色CD4 ， 绿色CD8 ， 蓝色DAPI ） ; 图 3c . 扁桃 体 组 织的 CD 80 &P D- L1 &C D16 3 &CD 2 06 mIH C 染色 （迈 杰荧 光合 成图 像 ， 青色CD80 ， 红色PD-L1 ， 黄色CD163 ， 绿色CD206 ， 蓝色DAPI ）

结 合机 器 学习 算 法， 分 析系 统 能够 识 别组 织 的形 态学区 域（如 肿瘤、真皮 、基质 、炎症）， 并 提供每个区 域 的细胞计数 和 密度，以进 一 步分析（如 特 定细胞表 型 之间的 距 离映射 ） 。除了 荧 光合成 图 像，分 析 系统还 能 够提供模 拟亮场 单色 IHC ，以改 进目 视判读。

作 为一 种 极具 潜 力的 免 疫治 疗 预测 方 法， m IH C正逐 渐出现 在肿瘤相关 领域研 究者的视野 中 。一个对G C 样本的研究 表 明，mIH C 能够精确地 显 示具有复 杂 免疫表 型 的各种 免 疫细胞 ， 以此表 征 TME 。 细胞角 蛋 白染色结 果图像 的数 字分割 可以显 示瘤 内和瘤周 TM E的空间信 息 ^[10] 。 通过对mI HC 结果 的进 一步 图像 分析 ，研 究人 员能 够实 现分 子的亚细 胞定位， 进一 步 拓展m IHC 的应用 ^{[ 10 ]} 。

参 考文 献

[ 1] I mm u no g en o mi c p rof ili ng deter mi ne rep on se to com bi ned PARPa nd P D-1 i nhi b iti o ni n ov a ria n ca n cer. Natu r eCom m unica t ion. 2 020

[ 2] H al l ma r k of ca n ce r: the next genera t ion. C ell. 2 011

[ 3] I mp r ov e d s ur v iv a l wit hi pilim uma bi np ati ent w ith me ta tat ic m ela n oma . N E ngl J Me d .20 10

[ 4] P D- 1 b l oc k ad e w ith nivo lumab in rela pe do rr efr act ory Ho dgk in' l ymp h oma . NE n gl J Me d .2 0 15

[ 5] P em b ro l iz u ma b f or the t reatme nt of non- m all- ce lll un gca nc er. NEn gl J M ed .2 01 5

[ 6] C om p re h en s iv e i ntr ame ta tatic i mmune quanti f icati o nand major impac t of i mmu n oc o re o n u rvi v al J Nat l Can ce rIn t.20 1 8.

[ 7] Q ua n ti t at i ve mu l ti ple xi mmuno hi toche m itry revea l mye l oid-i n flam e dtu m or- i mmu n ec o mpl e xit y a oci at ed wit h poor p rogno i.Ce l l R e p . 2 0 1 7

[ 8] H ig h ly mu l ti p le x ed imagi ngo f tumor ti sue with ubce ll ular r e olut ion b ym a sc y tom e try . Nat Me th od s.2 0 14

[ 9] C om p ar i o n o f B iom ark er Modal it ie for Pr edic ti ngR e pon e toP D-1/ PD -L 1C he ck po in t Bl oc ka de : AS y tem a ticR evie w and Me ta-an al yi. J AM A On co l, 2 01 9

[ 10 ] Hi g h- T hr o ug h pu t M ult ipl exIm mun ohit o chemi c alIm a ging o ft he T umo r an d It Mic r oen v iro n men t, Ca nc er Re sTr ea t,2 02 0

[ 11 ] Im p li c at i on s o ft he tu morim mu nem icro en viro nm ent fo rt ag ing and t her a peu t ic , Mod e rn P ath o logy ,20 1 8

原创：Alfred

编辑：Grace