杰论系列 | 流式细胞检测在受体占位中的应用

流式细胞术广泛运用于从基础研究到临床实践的各个方面，用于基于细胞层面不同亚群生物指标、分化状态、活化、增殖经历过程。免疫疗法的重点是通过抗体与不同免疫细胞亚群上的受体结合，并根据所其产生的激活或抑制功能现 象调整临床免疫反应策略。受体占位生物分析常用的检测技术为流式细胞技术。在免疫疗法中，RO作为药效学（PD）的生物指标，与药代动力学（PK）相结合，指导临床治疗应用。

受体占位检测，顾名思义是药物对细胞 表面靶受体占有情况的检测。在抗体药物对细胞靶向治疗的过程中，受体占位是一种重要的药效动力学生物指标。 R O 占有过低，可能会起不到治疗效果；而如果长期 RO 占有过饱和状态，会有过度结合，导致一定的副作用或者毒性。

受体占位在细胞靶向治疗生物药临床研究各个阶段都具有重要作用。

• 在临床I期，受体占位有助于药物从动物到人的靶点确证，考虑种属差异，受体表达丰度差异等因素，通常临床试验受体占位检测方法需要重新优化。

• 临床II期，受体占位确证药物浓度、受体结合、免疫原性抗药抗体( ADA) 和药效的关系。帮助确定临床有效剂量，指导决策。

• 临床III期，受体占位辅助确定抗体药物的群体PK特征。确定年龄、性别、体质量等协变量是否对生物药作用机制有影响。上市后，受体占位用于开发新适应症或下一代治疗剂的比较。特别是在早期临床，受体占位有助于建立基于最小生物学效应水平MABLE 的临床前到临床的准确首次人体剂量优化模型 ^[1] 。

• 自由检测法（ Free Receptor Assay） : 
  通过带有荧光信号的与药物竞争性的抗体占有未被生物治疗药物占用的受体来间接评价确定结合的受体（如图1）。有时也称为竞争法，竞争性抗体是结合与生物治疗剂相同或相似表位的抗体，这意味着它将结合未被生物治疗剂占用的自由受体。治疗性抗体，然后用同一抗体药物进行标记后染色，它只会与剩余的游离受体结合。

图1：自由检测法原理

•  药物占据直接检测法 （Bound Receptor Assay）：
  这是一种直接测定RO的检测方法，用荧光标记的特异性抗体与目标受体结合的生物治疗剂相结合是最常用的（如图2）。 对于该分析，评估结合的特 异性以及用于确定背景荧光的抗独特型的最佳浓度至关重要 ，合适的浓度可以降低测量背景，放大拷贝数受体特异性的检测信号 。

• 总受体检测法（ Total Receptor Assay）:
  它允许测量细胞表面的总受体。测量总受体的方法可用非竞争性抗体法和饱和药物法（如图3）。非竞争性抗体是一种荧光标记抗体，它与受体上的表位结合，与生物治疗剂识别的表位不同。饱和药物法是用饱和浓度的生物治疗药物预先孵育细胞，然后使用荧光标记的特型抗体检测生物治疗药物。用标记的生物治疗药物对处理后(剂量后)样品进行测试以检测游离受体。剂量前的总量用于所有剂量后的时间点，以计算受体占用(RO)。

  

图3：总受体检测法原理

ROA（RO Assay）设计之前考虑的因素：

表1：ROA考虑因素

[ 1 ]  中国临床药理学与治疗学 , 2020 Jan; 25

[2] Alessandra Audia, Gregory Bannish, Rachel Bunting and Chelsea Riveley (2022). Flow cytometry and receptor occupancy in immune-oncology. Expert opinion on Biological therapy. Vol.22, NO,1, 87-94.

[3] Jennifer J.Stewart, Cherie I.Green, Nicholas Jones, Yuanxin Xu, et al.(2016). Role of Receptor Occupancy Assays by Flow Cytometry in Drug Development. Cytometry B: (Clinical Cytometry) 90B:110-116.